高載量 PCR 片段純化試劑盒00 次說明書

操作步驟：
  高載量 PCR 片段純化試劑盒00 次說明書切取含有目的DNA 片段的瓊脂糖凝膠條帶。
   ● 盡量切除不含有目的DNA 部分的凝膠，減少凝膠體積，提高DNA 回收率。
   ● 切膠時(shí)，請(qǐng)使用長(zhǎng)波長(zhǎng)UV  （360 nm ）光盒。且不要將DNA 長(zhǎng)時(shí)間暴露在紫外燈下，以防DNA 損傷。
2  稱取凝膠的重量近似地確定其體積。
   ● 凝膠重量的稱量方法：取.5 ml 離心管電子天平稱初質(zhì)量，切膠裝在離心管后稱終質(zhì)量，兩者差即為膠的質(zhì)量。不同離心管的重量可能有差異，因此，每個(gè)離心管的重量需單獨(dú)稱量。
3  按照每00 mg 瓊脂糖凝膠對(duì)應(yīng)00 µl 溶液BD 的比例，向離心管中加入溶液BD。
4  50 ℃水浴7-0min，直至凝膠*溶化。期間需要振蕩混合3 次。
   ● 瓊脂糖必須*融化，以免堵塞柱子，嚴(yán)重影響DNA 段的回收效率。
   ● 如果總體積大于500 µl，可適當(dāng)增加溶膠時(shí)間。
   ● 若此時(shí)溶液變紅，可加0 µl 3M NaAC  （pH 5.2）。
5  將步驟4 所獲溶液置于DNA 純化柱中，靜置2min 。
   ● 膠塊*溶解后將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因?yàn)榧兓谳^高溫度時(shí)結(jié)合DNA  的能力較弱。
6  2,000 rpm 離心min。若溶液量大于DNA 純化柱的容積，可分兩次離心，棄濾液。
   ● 此時(shí)DNA 被吸附于DNA 純化柱中的硅膠膜上。
7  加入500 µl 溶液BD。2,000 rpm,  離心min，棄濾液
8  加入500 µl 溶液PE。2,000 rpm,  離心min，棄濾液。
   ● 溶液PE 初次使用前用無水乙醇按: 4 稀釋，即含80% 乙醇。
   ● 此步驟的作用是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質(zhì)洗脫，以獲得高質(zhì)量DNA 段。
9  加入500 µl 溶液PE。2,000 rpm,  離心min，棄濾液。
0 2,000 rpm 離心  3min ，以*去除純化柱中的液體。
   ● 此步驟的作用是去除殘留乙醇，避免殘留乙醇影響后續(xù)酶促反應(yīng)。同時(shí)也利于DNA 段的充分溶解。
  將離心柱置于新的.5 ml 離心管中。向純化柱的處，懸空滴加30-00 µl 溶液Eluent  （60℃預(yù)熱），靜置2min 。2,000 rpm  離心min，管底即為目的DNA 段。貯存于-20℃。
   ● 溶液Eluent 可用無菌雙蒸水代替，但其pH 需為8.0-8.5，加入體積視DNA 目的段的多少、用戶對(duì)目的濃度要求而定。
   ● 對(duì)溶液Eluent 60℃預(yù)熱，會(huì)提高提取DNA 目的段的產(chǎn)量。

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注意事項(xiàng)：
高載量 PCR 片段純化試劑盒00 次說明書● 溶液PE *次使用前請(qǐng)按瓶上標(biāo)簽加入4 倍體積的無水乙醇，即5 ml 溶液PE 中加入60 ml 無水乙醇，20 ml 溶液PE 中加入80 ml 無水乙醇，使用后立即蓋緊蓋子。
● 本產(chǎn)品對(duì)電泳使用的Agarose 種類沒有嚴(yán)格限制，可以使用普通Agarose 。為了保證回收DNA 的質(zhì)量和DNA 回收效率，希望使用高純度的Agarose ，但沒有必要一定要使用低熔點(diǎn)的Agarose 等。
● 電泳時(shí)請(qǐng)使用新鮮配制的TAE 電泳緩沖液，以免影響電泳及回收效果。
● 請(qǐng)適當(dāng)延長(zhǎng)電泳時(shí)間，在條帶分離清晰后進(jìn)行切膠回收，以免回收到多余雜帶。
● 為提高DNA 回收收率，切膠時(shí)應(yīng)盡量除去多余的膠塊。
● 本試劑盒純化柱的DNA 吸附能力強(qiáng)。但如果DNA 濃度小，或DNA 初始量少，回收率將會(huì)偏低。
● 溶液Eluent（0 mM Tris-HCl, pH 8.5）中不含EDTA，其收集的DNA 片段可直接用于各種酶促反應(yīng)等，不會(huì)影響后續(xù)試驗(yàn)。
● 為了保證回收效率，請(qǐng)不要使用未調(diào)整pH 值的超純水洗脫目的片段。
● 請(qǐng)嚴(yán)格按照操作步驟操作。

問：常用的DNA 濃度及純度檢測(cè)方法有哪些？
高載量 PCR 片段純化試劑盒00 次說明書答：回收得到的DNA 片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。瓊脂糖凝膠電泳通過對(duì)比定量的Marker 來定量濃度；紫外分光檢測(cè)OD260/280 比值，OD260/280 比值在.7-.9 之間說明所得  DNA  純度較好，如果洗脫時(shí)不使用溶液Eluent而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H 值和離子存在會(huì)影響光吸收值，但不表示純度低。

問：長(zhǎng)片段回收時(shí)應(yīng)注意哪些問題？
答：高載量 PCR 片段純化試劑盒00 次說明書當(dāng)DNA 片段長(zhǎng)度較長(zhǎng)（5   kb 以上）時(shí)，回收效率會(huì)有所下降，這是DNA 切膠回收時(shí)的常見現(xiàn)象。此時(shí)建議按以下方法解決問題：
    適當(dāng)增加待回收DNA 樣品的點(diǎn)樣量；
    2 由于長(zhǎng)片段DNA 不易從樹脂上洗脫下來，建議洗脫兩次，可以提高洗脫效率；
    3 減少操作過程中對(duì)長(zhǎng)片段DNA 的物理?yè)p傷，如混合振蕩操作不要過于劇烈，切膠時(shí)不要將DNA 長(zhǎng)時(shí)間暴露在紫外等下。

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